Оптогенетический инструмент управления экспрессией белков in vivo применили для терапии диабета

Китайские ученые создали оптогенетический инструмент, который позволяет точно регулировать экспрессию генов, имитируя нормальную экспрессию в живых системах. Представленная ими схема поможет глубже изучить механизмы экспрессии генов в клетках животных. В рамках работы, опубликованной в Nature Communications, исследователи также продемонстрировали потенциальное применение молекулярного инструмента в качестве терапии диабета первого типа.

Чтобы понимать, как функционирует тот или иной белок, как клетка отвечает на внешние и внутренние сигналы, необходимо иметь возможность анализировать, как именно экспрессируются гены, и, соответственно, вырабатываются белки. Принято считать, что при постоянных внешних условиях концентрация и функции ключевых регуляторных молекул в клетке не сильно меняются или случайным образом колеблются возле фиксированного значения.

Однако многие регуляторные белки, в том числе и транскрипционные факторы, функционируют «пульсирующим» образом и, соответственно, по-разному влияют на клеточную судьбу, ответ клетки на стрессовые условия и дифференциацию. Ученым удалось объяснить механизмы только некоторых таких пульсирующих механизмов. Создание управляемых пульсирующих систем может быть полезным для дальнейшего изучения их механизма и стоящих за ними биологических функций.

Выделение клетками инсулина относится к такой пульсирующей схеме. Инсулин — белковый гормон, который выделяют бета-клетки поджелудочной железы. Инсулин блокирует выделение глюкозы печенью и способствует тому, чтобы клетки использовали глюкозу, поступающую в кровь из пищи.

В исследовательских работах для управления экспрессией генов широко используются влияющие на нее химические вещества. Однако такие химические индукторы долго не распадаются и потому слишком долго влияют на экспрессию. И если в эксперименте на клеточных культурах можно физически убрать воздействующее вещество (поменять среду), то в экспериментах на животных такой возможности нет (нельзя обратно «отобрать» вещество из клеток животного), и практически невозможно динамично регулировать экспрессию, просто добавляя или убирая химическое вещество. Существуют альтернативные системы, в которых экспрессия генов зависит от света, но применение и таких систем сильно ограничено: сложно «доставить» необходимое количество света глубоко в ткани, потому что ткани сами по себе довольно сильно поглощают свет.

Проблема управления белками интересует не только тех, кто занимается экспрессией генов. Ранее нейробиологии разработали химерные белки, которые одновременно обладают и люминесценцией (способностью светиться), и чувствительностью к свету. Такая особенность позволяла им в присутствии субстрата «запускать» самих себя. Эти белки регулировали работу ионных каналов. В отличие от традиционных химических индукторов, субстрат люциферазы — белка, который издает свечение — легко и быстро используется люциферазой, а поэтому ответ белка быстро достигает своего пика и также быстро исчезает, что делает его динамичным.

Группа ученых из Восточно-китайского университета науки и технологий под руководством И Янa (Yi Yang) предложила использовать подобную систему, в которой сочетается химическая и световая регуляция, для управления экспрессией генов в клетках. Ученые решили создать химерный белок, состоящий из включаемого светом транскрипционного фактора и люциферазы. Для этого они соединили модифицированную люциферазу глубоководной креветки NanoLuc и LOV-домен (light-oxygen-voltage), чувствительный к свету белок растений и грибов, в одну молекулу. При этом LOV-домен хорошо поглощает синий свет (длина волны λ = 440–480 нанометров), а люцифераза NLuc как раз вырабатывает синий свет. Воздействовать на такую систему можно двумя способами: непосредственно светом или предоставляя люциферазе ее субстрат фуримазин. Эксперименты показали, что система действительно функционирует как логический элемент «ИЛИ». Экспрессия контролируемого химерным транскрипционным фактором белка возрастала в 116 раз при добавлении фуримазина с концентрацией 2,5 микромоль, и уменьшалась при дальнейшей увеличении концентрации субстрата.

Рост уровня экспресси белка в зависимости от воздействия на химерный транскрипционным фактор светом и фуримазином

Ting Li et al. / Nature Communications, 2021

Поделиться

По замыслу ученых, люцифераза в транскрипционном факторе быстро использует предоставленный ей субстрат, и как только он заканчивается, транскрипционным фактор перестает активировать транскрипцию гена. Для того чтобы проверить, насколько созданный ими фактор отвечает ожиданиям, исследователи измерили уровень экспрессии контролируемого им белка в зависимости от времени. Согласно результатам измерений, через 4-6 часов после добавления фуримазина уровень синтеза белка достигал максимума, а затем резко снижался.

Далее исследователи протестировали систему in vivo на животных моделях. Печень мышей трансфицировали плазмидами, в которых экспрессия репортерного флуоресцентного белка контролировалась разрабатываемым химерным транскрипционным фактором. После введения мышам фуримазина, экспрессия репортерного белка также достигала максимум через четыре часа и резко снижалась после. При этом амплитуда уровня экспрессии менялась с концентрацией вводимого фуримазина. Кроме того, экспрессию белка можно было повторно «включать» с интервалами в восемь часов.

В заключение группа ученых показала разработанную ими схему как потенциальный способ терапии диабета. Клетки, в которых выработка инсулина контролировалась химерным транскрипционным фактором, инкапсулировали в полупроницаемую мембрану. Пропускающая только низкомолекулярные соединения (< 72 килодальтон) мембрана защищает чужеродные клетки от физического контакта с иммунной системой животного-хозяина. Мышам с диабетом первого типа выдавали по пять миллиграмм фуримазина на киллограмм массы животного и измеряли содержание глюкозы в крови спустя три часа. Уровень глюкозы у мышей с имплантированными клетками снизился по сравнению с остальными (мышами без импланта, не получившими фуримазин мышами).

Ученые отмечают, что эффект от перорального приема фуримазина был сопоставим с внутривенным и внутрибрюшинным введением вещества. Пероральный способ — наиболее предпочтительный, потому что не вызывает боль и тревожность у животных и людей. К тому же, на данный момент не существует пероральной терапии диабета первого типа — пациенты вынуждены делать внутримышечные инъекции инсулина, чтобы контролировать содержание глюкозы в крови после приемов пищи.

Также исследователи заметили, что оптимальная доза фуримазина, достаточная для поддержания необходимого уровня глюкозы в крови, была разной в зависимости от интервалов времени между приемами пищи. Возможно, это позволит создать клеточную терапию, дозировку которой можно будет корректировать в зависимости от пищевых привычек пациентов.

Возможности методов оптогенетики давно привлекают исследователей, и они часто экспериментируют с их применением на животных. Например, одни ученые внедрили информацию о песнях в мозг молодых амадин, а другие вернули зрение макакам, превратив их нервные клетки в фоторецепторы.

Вера Сысоева

https://nplus1.ru/